MeiraGTx Holdings plc ha annunciato che la Società esporrà otto poster e terrà una presentazione orale al Congresso Annuale della Società Europea di Terapia Genica e Cellulare (ESGCT) 2023, che si terrà dal 24 al 27 ottobre 2023, a Bruxelles, in Belgio. Poster #122: Sviluppo di alternative alla lisi cellulare con Triton X-100 per il recupero primario di AAV2, AAV5 e AAV8; Categoria: AAV e vettori non integrativi; Il Triton X-100 è un detergente efficace per il recupero dei prodotti biologici dai compartimenti intracellulari, ma il suo uso è ora vietato dalle normative REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals), in quanto la sua degradazione genera un composto che ha un impatto negativo sulla vita acquatica. Questo lavoro mirava a sviluppare metodi alternativi al Triton X-100 per il recupero del Virus Adeno-Associato (AAV) dalle cellule del Rene Embrionale Umano 293, che fossero conformi alla normativa REACH, compatibili con le Buone Pratiche di Fabbricazione, che non influissero sulla qualità del prodotto e che mostrassero un recupero del prodotto comparabile rispetto alla lisi con Triton X-100.

Sono stati valutati due metodi alternativi di rilascio di AAV per i sierotipi AAV2, AAV5 e AAV8: 1) Un metodo di rilascio iperosmotico senza detergenti è stato inizialmente testato su scala microplacca, utilizzando un approccio di tipo Central Composite Design of Experiment, prima di passare alla scala STR (stirred tank reactor) da 250 mL. 2) Quando non era adatto, un metodo di lisi che utilizzava il detergente Deviron C16 è stato valutato su scala STR da 250 ml, con concentrazioni che andavano dallo 0,1 allo 0,5%. Infine, le condizioni di successo per entrambi i metodi sono state scalate su scala STR da 10 litri.

Per il sierotipo AAV8, un metodo di rilascio iperosmotico dell'AAV ha impiegato l'aggiunta di 400 mM NaCl e l'incubazione per 2 ore, portando ad un recupero del VG di circa il 70% rispetto al metodo tradizionale Triton X-100. Per i sierotipi AAV2 e AAV5, il metodo di lisi Deviron C16 allo 0,5% si è dimostrato più adatto, con recuperi di VG rispettivamente dell'87% e del 97% rispetto al rilascio di AAV con Triton X-100. Non sono state necessarie modifiche al processo a valle per adattarsi a questi metodi alternativi.

Inoltre, entrambi i metodi erano scalabili fino a 10 L di scala STR, e le impurità legate al processo, tra cui il DNA residuo e le proteine delle cellule ospiti, così come la potenza del prodotto, non sono state influenzate da questi metodi. In conclusione, questo studio dimostra due metodi alternativi ottimizzati per il rilascio di AAV, in sostituzione dell'uso di Triton X-100, che hanno mostrato profili di recupero e qualità del prodotto comparabili. Poster #167: Sviluppo di linee cellulari con test di potenza per vettori di terapia genica oculare; Categoria: AAV e vettori non integrativi; Nella produzione di prodotti farmaceutici AAV GMP, la capacità di valutare la loro potenza è una parte essenziale del rilascio e della stabilità.

I saggi di potenza basati sulle cellule sono un requisito normativo per la commercializzazione delle terapie geniche AAV, ma la scarsa trasducibilità di AAV in vitro e l'impossibilità di testare l'espressione a causa dell'uso di promotori specifici per i tessuti ostacolano lo sviluppo di saggi efficienti e robusti. Allo stesso modo, la ricerca preclinica di base, dove sono auspicabili test facili da implementare per esperimenti e iterazioni più veloci, soffre delle stesse limitazioni. L'azienda ha quindi cercato di esaminare i modi per aumentare la trasducibilità dei vettori e stabilire la trans-attivazione del promotore oculare nelle linee cellulari più comunemente utilizzate (HEK293 e HeLa).

La società ha valutato diversi metodi per aumentare la trasducibilità dei vettori AAV5 e AAV8 e per transattivare i promotori specifici dei fotorecettori (Rhodopsin kinase) e RPE (RPE65). Negli esperimenti di dose-ranging, abbiamo identificato potenti trans-attivatori mediati da dCas9 per entrambi i promotori e abbiamo stabilito un'integrazione di fattori esogeni che ha aumentato la trasducibilità di entrambi i capside di molte volte rispetto al basale. Ulteriori studi consentiranno di combinare questi elementi in una piattaforma di test di potenza in vitro basata su cellule per il rilascio di lotti GMP e i test di stabilità.

Poster #324: Uso della modellazione meccanicistica per progettare un processo di piattaforma per la separazione dei capside AAV pieni e vuoti; Categoria: Produzione I virus adeno-associati sono relativamente nuovi nel campo delle modalità biofarmaceutiche e vengono utilizzati per consegnare un gene terapeutico al paziente. Durante la loro produzione a monte, vengono utilizzati processi cellulari separati per produrre il capside virale e il transgene terapeutico, e per confezionare il transgene all'interno del capside. Questo porta all'espressione di capside vuoti, che devono essere rimossi durante il processo a valle, perché potrebbero stimolare una risposta immunitaria nel paziente.

La separazione dei capsidi vuoti rappresenta una sfida a causa della somiglianza delle proprietà tra i capsidi vuoti e quelli pieni. La proporzione di capsidi vuoti può variare molto e raggiungere il 90% a seconda della maturità del processo a monte, il che può aumentare ulteriormente la sfida di ottenere questa separazione. La maggior parte dei tentativi si è concentrata sull'utilizzo della cromatografia a scambio anionico per sfruttare la differenza di carica per ottenere questa separazione.

Tuttavia, esiste una grande diversità negli approcci pubblicati, con alcuni gruppi che utilizzano diversi tipi di matrice (resine, membrane e monoliti), condizioni di processo e additivi. L'azienda ha dimostrato in precedenza che la partizione debole può essere utilizzata per massimizzare l'arricchimento dei capside completi, il che aumenta ulteriormente le opzioni disponibili per questa separazione. La definizione di un processo di piattaforma comporta in genere lo screening di un certo numero di opzioni, utilizzando l'euristica per restringere lo spazio di progettazione e ridurre l'onere sperimentale.

Questo porta in genere a confrontare le opzioni di processo a condizioni non ottimali e c'è il rischio di non identificare la piattaforma ottimale. Questa presentazione si concentrerà sul lavoro svolto per dimostrare che i modelli meccanici possono essere utilizzati per identificare un processo di piattaforma ottimale per l'arricchimento dei capsidi completi di AAV2. In questo studio, sono stati sviluppati modelli meccanici per la separazione dei capside AAV2 pieni e vuoti per tre matrici AEX che avevano precedentemente dimostrato di essere promettenti durante la valutazione sperimentale.

Questi modelli sono stati poi utilizzati per esaminare una serie di condizioni di processo (concentrazioni di sale, rapporti di carico) e le modalità di funzionamento (legare ed eluire, flowthrough, partizione debole) e identificare le condizioni ottimali per ciascuna matrice. Infine, le condizioni ottimali identificate sono state verificate sperimentalmente.